華東理工大學副教授周勝敏團隊系統(tǒng)闡明了限制CRISPR精準敲入效率的關(guān)鍵DNA修復(fù)機制，并提出了一種具有普適性的高效同源重組設(shè)計策略，為基開云kaiyun因編輯中插入位點依賴性強、目標片段難以高效敲入的問題提供了可預(yù)測、可推廣的解決方案。相關(guān)研究成果近日發(fā)表于《核酸研究》。

　　CRISPR-Cas9是當前最重要的基因組編輯技術(shù)之一，可在單鏈向?qū)NA（sgRNA）的引導下，在基因組特定位點進行切割，使得DNA雙鏈斷裂，并借助細胞內(nèi)DNA修復(fù)通路實現(xiàn)基因改造。在生物體內(nèi)，外源序列的精準插入通常依賴同源定向修復(fù)（HDR）過程。然而，在真菌等體系中，HDR效率常受到切割位點位置、插入片段長度以及修復(fù)通路競爭等多重因素制約，導致部分插入位點長期存在“難以敲入”的問題。

　　研究團隊從DNA修復(fù)過程中的空間幾何約束出發(fā)，發(fā)現(xiàn)供體DNA與染色體鏈侵入路徑之間的幾何錯位，是導致HDR介導精準敲入效率下降的關(guān)鍵原因。研究團隊解析了同源重組相關(guān)蛋白在雙鏈斷裂周圍的方向性加載規(guī)律，明確了有效修復(fù)窗口的空間特征。

　　在此基礎(chǔ)上，研究開云kaiyun團隊提出了雙向切割形成幾何對齊窗口的設(shè)計策略。具體而言，通過在目標位點兩側(cè)引入成對的sgRNA進行切割，實現(xiàn)供體同源臂與內(nèi)源DNA修復(fù)路徑的空間匹配，從而穩(wěn)定提升精準敲入效率。

　　系列實驗結(jié)果表明，該策略在不同插入片段長度及多類編輯任務(wù)中均表現(xiàn)出良好適用性，并可推廣應(yīng)用。

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